蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威等 5种农药残留快速检测方法

 
1　范围
本方法规定了蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威等5种农药残留快速检测方法。
本方法适用于油菜、菠菜、芹菜、韭菜等蔬菜中敌敌畏、敌百虫、丙溴磷、克百威、灭多威等5种农药残留的快速测定。
 
酶抑制（率）法（分光光度法）
2　原理
在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率。
3　试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1　试剂
3.1.1　丙酮（CH₃COCH₃）。
3.1.2　磷酸氢二钾（K₂HPO₄）。
3.1.3　磷酸二氢钾（KH₂PO₄）。
3.1.4　5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（C₁₄H₈N₂O₈S₂）。
3.1.5　碳酸氢钠（NaHCO₃）。
3.1.6　碘化乙酰硫代胆碱（ C₇H₁₆INOS）。
3.1.7　pH8.0缓冲溶液：分别称取11.9g无水磷酸氢二钾及3.2g磷酸二氢钾，溶解于1000mL水中，混匀。
3.1.8　显色剂：分别取160mg 5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱中保存。
3.1.9　底物：取125mg碘化乙酰硫代胆碱，加15mL蒸馏水溶解，摇匀后置于4℃冰箱中保存备用。保存期不超过两周。
3.1.10　乙酰胆碱酯酶：4℃冰箱中保存备用。
3.2　参考物质
3种有机磷和2种氨基甲酸酯类农药参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度均≥98%。
表1 有机磷和氨基甲酸酯类参考物质中文名称、英文名称、
CAS登录号、分子式、相对分子质量

序号	中文名称	英文名称	CAS登录号	分子式	相对分子质量
1	克百威	Carbofuran	1563-66-2	C12H15NO3	221.25
2	灭多威	Methomyl	59669-26-0	C5H10N2O2S	162.23
3	丙溴磷	profenofos	41198-08-7	C11H15BrClO3PS	373.63
4	敌敌畏	Dichlorvos	62-73-7	C4H7Cl2O4P	220.98
5	敌百虫	Dipterex	52-68-6	C4H8Cl3O4P	257.44

3.3　标准溶液的配制
3.3.1　克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准储备液（1000μg/mL）：冷藏、避光、干燥条件下保存。
3.3.2　丙溴磷标准储备液（100μg/mL）：冷藏、避光、干燥条件下保存。
3.3.3　克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫标准中间液A（100μg/mL）：精密移取上述标准储备液（1000μg/mL）（3.3.1）各1mL，分别置于10mL容量瓶中，用丙酮（3.1.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 μg/mL的标准中间液A。
3.3.4　克百威、灭多威、敌敌畏、敌百虫、丙溴磷标准中间液B（1μg/mL）：精密移取标准中间液A（100μg/mL）（3.3.3）及丙溴磷标准储备液（100μg/mL）（3.3.2）各1mL，分别置于100mL容量瓶中，用缓冲溶液（3.1.7）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1 μg/mL的标准中间液B。
4　仪器和设备
4.1　恒温水浴锅。
4.2　天平：感量为 0.01 g和0.1mg。
4.3　分光光度计或相应商品化测定仪。
4.4　环境条件：温度15℃~35℃，湿度≤80%。
5　分析步骤
5.1　试样的提取
5.1.1　整株提取法
选取韭菜、芹菜有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3g（精确至0.01g）置于表面皿中，加入10mL缓冲液（3.1.7），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50次，静置2min以上，取上清液备用。
5.1.2　整体测定法
选取油菜、菠菜有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，称取3g（精确至0.01g）放入离心管中，加入10mL缓冲溶液（3.1.7），振摇50次，静置2min以上，倒出提取液，静置3min~5min，待用。
5.2　测定步骤
5.2.1　对照液的测定
先于反应管中加入3mL缓冲溶液（3.1.7），再加入适量酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37℃水浴锅中放置15min。加入0.1mL底物摇匀，立即测定吸光度，3min后再测定一次，记录反应3min的吸光度值的变化∆A₀。
5.2.2　样品液的测定
先于反应管中加入3mL提取液，其他操作与对照液操作（5.2.1）相同，记录反应3min的吸光度值的变化∆A_t。
5.3　质控试验
每次测定应同时进行空白试验和加标质控试验。
5.3.1　空白试验
称取空白试样，按照 5.1 和 5.2 步骤与样品同法操作。
5.3.2　加标质控试验
5.3.2.1　韭菜、芹菜加标实验
取空白试样，擦去表面泥土，称取5份试样各3g（精确至0.01g）置于表面皿中，分别加入检测限水平的各有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液 B（1 μg/mL）（3.3.4），加入10mL缓冲液（3.1.7），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50次，静置2min以上，取上清液备用。
其余操作按照 5.2 步骤同法操作。
5.3.2.2　油菜、菠菜加标实验
取空白试样，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，称取5份试样各3g（精确至0.01g）放入小离心管中，分别加入检测限水平的各有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液 B（1 μg/mL）（3.3.4），加入10mL缓冲溶液（3.1.7），振摇50次，静置2min以上，倒出提取液，静置3min~5min，待用。
其余操作按照 5.2 步骤同法操作。
6　结果的表述
6.1　结果计算
抑制率（%）=[（∆A₀-∆A_t）/∆A₀]×100
式中：
∆A_0───对照溶液反应3min吸光度的变化值；
∆A_t───样品溶液反应3min吸光度的变化值；
6.2　结果判定
结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。
当抑制率≥50%时，表示蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留高于检测限，判定为阳性，阳性结果的样品需要重复检验2次以上。
6.3　质控试验要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。
7　结论
当检测结果为阳性时，应采用其他分析方法进行确证，进一步确定农药品种和含量。
8　性能指标
8.1　检测限：克百威0.1mg/kg，灭多威0.2mg/kg，丙溴磷0.5mg/kg，敌敌畏0.2mg/kg，敌百虫0.1mg/kg。
8.2　灵敏度：灵敏度应≥99%
8.3　特异性：特异性应≥85%。
8.4　假阴性率：假阴性率应≤5%。
8.5　假阳性率：假阳性率应≤15%。
注1：性能指标计算方法见附录A。
注2：吸光度变化∆A₀值应控制在0.2~0.3之间。具体的酶量，应根据产品说明书上标识的使用量，测定∆A₀值。
根据测定值，增加或减少酶量，使∆A₀值控制在0.2~0.3之间。
检测卡法
9　原理
样品中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留经缓冲液提取，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶（白色药片）有抑制作用，抑制胆碱酯酶催化靛酚乙酸酯（红色药片）水解为乙酸与靛酚（蓝色），从而导致速测卡颜色深浅的变化。通过空白颜色比较，对样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药进行定性判定。
10　试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
10.1　试剂
10.1.1　丙酮（CH₃COCH₃）。
10.1.2　磷酸氢二钾（K₂HPO₄）。
10.1.3　磷酸二氢钾（KH₂PO₄）。
10.1.4　pH8.0缓冲溶液：分别称取11.9g无水磷酸氢二钾及3.2g磷酸二氢钾，溶解于1000mL水中，混匀。
10.2　参考物质
同3.2。
10.3　标准溶液的配制
同3.3。
10.4　固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的纸片（检测卡）。
11　仪器和设备
11.1　恒温水浴锅。
11.2　天平：感量为 0.01g和0.1mg。
11.3　环境条件：温度15℃~35℃，湿度≤80%。
12　分析步骤
12.1　试样的提取
12.1.1　整株提取法
选取韭菜、芹菜有代表性的样品，擦去表面泥土，称取试样3g（精确至0.01g）置于表面皿中，加入10 mL缓冲液（10.1.4），残缺面不得接触缓冲液，轻轻振摇50次，静置2min以上。
12.1.2　整体测定法
选取油菜、菠菜有代表性的样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，称取3g（精确至0.01g）放入小离心管中，加入10mL缓冲溶液（10.1.4），振摇50次，静置2min以上。
12.2　测定步骤
吸取适量待测液于白色药片反应区域，在37℃恒温装置中放置15min进行预反应，预反应后的药片表面必须保持湿润。
将速测卡对折，保证红色药片反应区域与白色药片反应区域完全叠合发生反应。
每次测定需有一个缓冲溶液的空白对照。
12.3　质控试验
每次测定应同时进行空白试验和加标质控试验。
12.3.1　空白试验
称取空白试样，按照 12.1 和 12.2 步骤与样品同法操作。
12.3.2　加标质控试验
12.3.2.1　韭菜、芹菜
取空白试样，擦去表面泥土，称取5份试样各3g（精确至0.01g）置于表面皿中，分别加入检测限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液 B（1 μg/mL）（3.3.4），按照12.1和12.2步骤与样品同法操作。
12.3.2.2　油菜、菠菜
选取空白试样，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，称取5份试样各3g（精确至0.01g）放入小离心管中，分别加入检测限水平的有机磷和氨基甲酸酯类标准中间液 B（1 μg/mL）（3.3.4），按照 12.1 和 12.2 步骤与样品同法操作。
13　结果判定
白色药片区域不变色或略有浅蓝色为阳性结果；白色药片区域变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。通过对比空白和样品白色药片区域的颜色变化进行结果判定。目视判定示意图见图1。
13.1　无效
白色药片区域干燥，表明取样量偏少，检测结果无效。
13.2　阴性
样品白色药片区域颜色比空白对照卡颜色颜色相当或为天蓝色，表明样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留农残低于方法检测限，判定为阴性。
13.3　阳性
样品白色药片区域不变色或略有浅蓝色，表明样品中有机磷和氨基甲酸酯类农残高于检测限，判定为阳性。

图1 目视判定示意图
 
13.4　质控试验要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应均为阳性。
14　结论
当检测结果为阳性时，应采用其他分析方法进行确证，进一步确定农药品种和含量。
15　性能指标
15.1　检测限：克百威0.1mg/kg，灭多威0.2mg/kg，丙溴磷0.5mg/kg，敌敌畏0.2mg/kg，敌百虫0.1mg/kg。
15.2　灵敏度：灵敏度应≥99%
15.3　特异性：特异性应≥85%。
15.4　假阴性率：假阴性率应≤5%。
15.5　假阳性率：假阳性率应≤15%。
注3：性能指标计算方法见附录A。
16　其他
葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，采取整株蔬菜浸提。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株蔬菜浸提的方法，减少色素的干扰。
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。
本方法参比标准为NY/T 761-2008 《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》。
 
 
附录A
定性方法性能计算表
 
表 A.1性能指标计算方法

样品情况a	检测结果b		总数
	阳性	阴性
阳性	N11	N12	N1.=N11+N12
阴性	N21	N22	N2.=N21+N22
总数	N.1=N11+N12	N.2=N21+N22	N=N1.+N2.或N.1+N.2
显著性差异(х2)	c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1
灵敏度(p+)	p+=N11/N1.
特异性(p-)	p-=N22/N2.
假阴性率(pf-)	pf-=N12/N1.=1-灵敏度
假阳性率(pf+)	pf+=N21/N2.=1-特异性
相对准确度	(N11+N22)/(N1.+N2.)
注：N指任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N2.表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。
a由基准方法检验得到的结果； b由本方法得到的检测结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。